pull down實(shí)驗(yàn)檢測(cè)測(cè)試服務(wù)

樣品要求

蛋白樣品-80℃保存，干冰寄送，下單前請(qǐng)先和工作人員溝通，確認(rèn)測(cè)試細(xì)節(jié)。

常見問題

為什么會(huì)有假陽性的結(jié)果出現(xiàn)？

由于內(nèi)源性蛋白的干擾，高純度的GST融合蛋白能夠減少實(shí)驗(yàn)的假陽性。由于高純度的融合蛋白能減少實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陽性，因此獲得高純度的融合蛋白對(duì)于GST-pull down 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 分析具有重要的作用。同時(shí)，為了能夠程度的保證融合蛋白原有的生物學(xué)活性，一般在獲取融合蛋白時(shí)傾向于可溶性融合蛋白，因此獲得高純度的可溶性蛋白很關(guān)鍵。 對(duì)于可溶性蛋白的獲得條件主要有載體的選擇。可溶性蛋白表達(dá)條件的選擇，誘導(dǎo)溫度，誘導(dǎo)時(shí)間，誘導(dǎo)物的濃度，能夠不被細(xì)胞代謝而且具有穩(wěn)定的濃度。

DNA pull down 常見問題

1：適配子DNA單鏈，可以用帶有互補(bǔ)鏈的磁珠進(jìn)行pull down嗎？如果可以，效率怎么樣？一般需要怎么優(yōu)化條件？

理論上說,若DNA單鏈能夠與磁珠上的互補(bǔ)鏈雜交成功,是可以進(jìn)行pull down實(shí)驗(yàn)的; 效率如何不好確定,這個(gè)取決于兩條DNA單鏈?zhǔn)欠衲茈s交成功、蛋白-DNA結(jié)合的強(qiáng)弱、蛋白的豐度等。

2：DNA pull down的 原理？

針對(duì)目標(biāo)區(qū)域設(shè)計(jì)特異性DNA探針并進(jìn)行生物素標(biāo)記，生物素探針可與偶聯(lián)在磁珠上的鏈霉親和素結(jié)合；細(xì)胞蛋白提取物與磁珠-DNA探針孵育，從而釣取與DNA探針有特異性結(jié)合的互作蛋白質(zhì)。

3：你們對(duì)外服務(wù)的檢測(cè)項(xiàng)目有哪些？

細(xì)胞、動(dòng)物/植物組織、菌體都可以做DNA pull down, 我們還可以做的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)具體如下:

(1) RNA-蛋白/RNA互作及定位：RNA pull down、RIP、fish等;

(2) DNA-蛋白互作：DNA pull down、ChIP、EMSA、雙熒光素酶、酵母單雜等;

(3) 蛋白-蛋白互作：GST/his pull down、CoIP、酵母雙雜等;

(4) 細(xì)胞學(xué)檢測(cè)：細(xì)胞增殖-MTT/CCK-8, 細(xì)胞凋亡, 細(xì)胞周期,細(xì)胞遷移、侵襲：劃痕愈合/Transwell/Transwell（Matrigel）等;

(5) 外泌體服務(wù)：提取、鑒定(Nanosight粒徑檢測(cè)/電鏡/WB)、

測(cè)序(miRNA/lncRNA)、蛋白質(zhì)組學(xué);

(6) 轉(zhuǎn)錄組及蛋白質(zhì)組：真核有參轉(zhuǎn)錄組、無參轉(zhuǎn)錄組、真核lncRNA、small RNA等。

4：效率有多高？

效率主要取決于蛋白-DNA結(jié)合的強(qiáng)弱、蛋白的豐度等。

5：老師，對(duì)照組的DNA序列是怎么選擇的？

一般對(duì)照組是沒有探針的,對(duì)照組是磁珠beads+蛋白。

6：DNA pull down有什么缺陷嗎？

DNA pull down-MS是體外研究蛋白-DNA是否有直接互作的經(jīng)典技術(shù)，是將探針結(jié)合在凝膠/磁珠上，釣取與DNA探針有互作的蛋白；就技術(shù)而言,沒有明顯的缺陷;后續(xù)質(zhì)譜能鑒定到多少蛋白取決于蛋白-DNA結(jié)合的強(qiáng)弱、蛋白的豐度等。

7：做DNA pulldown 用DNA單鏈好還是雙鏈好？

常規(guī)的是用DNA雙鏈作為探針。

8：可以簡單講一下生物素標(biāo)記引物的原理嗎？

主要利用生物素（biotin）和親和素（avidin）這兩種分子的獨(dú)特性質(zhì); 親和素的每個(gè)亞基都能結(jié)合一個(gè)生物素分子,兩者的結(jié)合是通過生物素的脲基環(huán)部分完成的;因此可將其戊suan側(cè)鏈通過酰胺鍵與核酸分子相連，構(gòu)成生物素標(biāo)記的核酸探針。